Don Vincenzo Borghini hizo el programa y Giorgio Vasari fue el artista encargado de realizar la decoración; veinte pintores y cinco escultores participaron en la ejecución. El programa de Borghini estaba condicionado por los objetos destinados a los armarios. Estos eran piedras preciosas, metales, retortas y alambiques, tratados de alquimia, fósiles animales y vegetales, azufre, mercurio y diversos elementos y útiles de alquimista. Así Borghini escribe: «Considerando que cosas símiles no son completamente ni de la naturaleza ni del arte, pero participan de ambos, ayudándose mutuamente, pensé que toda esta invención (la decoración del gabinete) fuese dedicada a la naturaleza y al arte». La clave iconográfica es el centro de la bóveda, para la cual Borghini prescribe que «...se representará la naturaleza, que tendrá en su compañía a Prometeo, el primer inventor de las piedras preciosas y de los anillos (Prometeo, junto con Hércules, Diógenes, y Moisés, es la imagen del alquimista iniciado). Prometeo es castigado porque robó el fuego a los dioses para donárselo a los hombres² como medio para reencontrar su antigua unidad andrógina de la que habla Platón, unidad que acerca los hombres a los dioses.» Pernety describió la naturaleza de este fuego: «Nuestro fuego filosofal es un laberinto en cuyos recovecos los más hábiles pueden perderse porque este fuego está oculto y secreto. El fuego del sol no puede ser este fuego secreto porque es discontinuo y desigual. El fuego vulgar de la cocina impide la amalgama de las sustancias susceptibles de ser mezcladas, consuma y hace evaporar los légamos sutiles de la mezcla constitutiva, es un tirano. El fuego central de la materia tiene la propiedad de mezclar las substancias y de darles nueva forma, pero este fuego tan famoso no es el fuego común.»³  

También Giovanni Pontano nos habla de la cualidad de este fuego filosófico: «Nuestro fuego es mineral y eterno, participa del azufre, disuelve, congela, calcina todas las cosas. Este fuego húmedo es necesario en todas las operaciones alquímicas, en el principio, en la mitad y en el fin de la obra, porque toda la ciencia está en este fuego. Es un fuego natural, sobrenatural y antinatural, al mimo tiempo caliente, seco, húmedo y frío, no quema y no destruye. Hace falta mucha habilidad para descubrirlo, y para prepararlo cuesta muy poco. Está cargado de vapor, es penetrante, sutil, dulce, eterno. Transforma y no se inflama, no se consuma, rodea todo, contiene todo; es el único fuego de su especie. Es la fuente de agua vital en la cual se bañan continuamente el rey y la reina de la naturaleza. Ciertamente los filósofos lo han tenido siempre en secreto, pero yo quiero revelar la propiedad de este fuego junto al cumplimiento de toda la obra. La piedra filosofal es una y se llama de varios modos, y te será muy difícil reconocerla. De hecho es de naturaleza acuosa, aérea, ígnea y terrestre; es flemática, sanguínea, colérica y melancólica. Es sulfúrea y al mismo tiempo mercurio vivo». He aquí la piedra que la naturaleza ofrece a Prometeo, he aquí la conclusión de la obra, ya que la piedra existe, pero está escondida y es invisible.

En la cúpula pintada al fresco Prometeo está en la salida de una gruta, el espacio y tiempo interior, donde se genera y madura el germen, el semen del huevo del mundo, que en su resurrección dará orden al caos. Prometeo sostiene en la mano izquierda el fuego filosófico, el azufre incombustible que aclara y ordena las tinieblas del caos, y le permite ver el futuro y el pasado, y unirlos en el tiempo presente. Con la mano derecha toma la piedra que le ofrece la naturaleza. La Virgen tiene un niño en el pecho, una serpiente que se desliza sobre su vientre y un unicornio que es el protector de las vírgenes. En tierra un ramo de coral rojo, la conclusión de la obra, la piedra roja. El niño que se amamanta es el «hijo de la Filosofía», el recién nacido andrógino que se nutre de la leche de la naturaleza. La liebre que tiene en sus brazos es un símbolo de Venus y representa la fecundidad de la eterna creación sin principio ni fin. El niño que vuela y abre los brazos hacia Prometeo y mira a la naturaleza, es la «carne de vida» que está escondida en el aire. La Virgen representa el aspecto pasivo mercurial, mientras que el unicornio es el símbolo de las fuerzas masculinas que penetran el espíritu mercurial. La serpiente es el mercurio elemental, principio que lleva a la madurez y a la perfección, por ello llamado «liberador y salvador». Es la serpiente que cuando se muerde la cola se torna uroboros. Símbolo de lo infinito, el Uno-Todo, la totalidad, y la superación del caos, porque en la circularidad se reconoce un primer elemento de orden en el interior del movimiento confuso.

Continúa Borghini: «Siendo las paredes del gabinete cuatro y cuatro los elementos de la naturaleza, yo pondría uno en cada pared, ya que estos elementos son los principales maestros en este mundo de la naturaleza (agua, fuego, aire y tierra, con cuya sabia mezcla se sigue el procedimiento para conseguir formar la piedra roja). La tierra fue representada sobre la pared de la entrada, el fuego sobre el lado derecho, el agua sobre el izquierdo, y el aire sobre la pared del fondo.» Para los cuatro espacios restantes en los ángulos del techo, Borghini dispuso parejas de angelotes abrazados, para indicar que en los cuatro elementos conviven cualidades que resultan de «aquella admirable cadena de la naturaleza que conserva el todo.» Y añade Borghini: «Y así hace la naturaleza esta bella danza y también nosotros los humanos tenemos nuestros cuatro elementos: la melancolía fría y seca como la tierra, la flema fría y húmeda como el agua, la sangre húmeda y caliente como el aire y la cólera caliente y seca como el fuego (correspondencia alquímica entre los cuatro elementos y los cuatro humores existentes en el alma humana).»

Las estatuas del gabinete representan también los cuatro elementos en forma de los dioses del Olimpo: «En el lado de la tierra la estatua de Plutón, dios de la riqueza; oro, plata y metales preciosos son sus atributos. Su compañera es la diosa de la tierra Ops (Ceres) a la cual corresponden los pórfidos, diaspros, mármoles y mezclas finas» (recordemos que el oro alquímico, filosófico, se encuentra en la Tierra).⁴  

Para representar el agua Borghini quería «...dos estatuas de mujeres, porque el agua es muy generadora», como para el fuego quería las dos estatuas masculinas, ya que «el fuego es activísimo» (recordemos que el agua mercurial es volátil, caos primordial generador; el fuego, azufre, masculino, fijo y activo). Para el agua se escogieron a Venus y Anfitrite.⁵ Venus, agua, femenino, mercurio, luna. Para el fuego Apolo, señor de la luz y del calor, y naturalmente a Vulcano.⁶  Para el aire fueron escogidos Juno, gobernadora de los matrimonios, y Zéfiro, el viento del poniente que anuncia la Primavera.⁷  

Las pinturas situadas bajo la bóveda tienen ingeniosas referencias alquímicas. Por ejemplo, para el lado dedicado a la tierra «hay personas que cavan minas, piedras, metales» (el hombre iniciado a la búsqueda de la piedra filosofal). Para el aire, una historia extravagante, esto es, que «fingiera montes escarpados en donde con escaleras de cuerda y otros utensilios hubieran hombres que buscaran diamantes y cristales» (la ascensión del iniciado por la escalera del conocimiento). Para las dos lunetas debajo del techo, hoy día con las imágenes de Cosme y Eleonora de Toledo, Borghini había, en principio, propuesto representaciones de las cuatro estaciones (pues sabemos que la gran obra se cumple siguiendo los ciclos marcados por las cuatro estaciones). Múltiples son, como hemos dicho, los paralelismos agrícolas encontrados en los tratados alquímicos. Actualmente los dos retratos circulares están rodeados por signos del zodíaco, evidentemente de acuerdo con lo que se había proyectado para las cuatro estaciones. Por otro lado, es notoria la relación existente entre los planetas, los signos del zodíaco, los metales, los humores y las diversas etapas de la alquimia. Es importante señalar que el gabinete de Francisco I fue el barómetro de todas las tendencias del panorama artístico florentino del último período del 1500; esto es, la célebre maniera fue llevada a sus últimas consecuencias. Con el gabinete de Francisco I se consolidó el manierismo europeo, que unía las teorías artísticas de las cortes europeas: de los Médici de Florencia a la corte de Fontainebleau, de los Habsburgo de Praga al Wittelsbach de Mónaco. La maniera tuvo tres momentos: el primer manierismo fue el reflejo de una visión abstracta, puramente mental e introspectiva, hasta el punto que mantiene un equilibrio entre un estado de tensión interna y un aspecto de perfección formal externa. El segundo manierismo (Vasari y sus seguidores) se torna una fórmula más plana, poco sutil, muy eficaz para las grandes empresas decorativas. Los primeros manieristas, Pontormo, Rosso, Parmigianino, Beccafumi, Bronzino, los podemos considerar cercanos a la cosmovisión alquímica. Sus sucesores, Vasari y seguidores, estaban privados de toda concepción cosmogónica, y se limitaban a decorar para el estado mediceo. Los últimos manieristas⁸ tenían dos posibilidades: o volver la espalda a Vasari y retornar a las más sutiles y puras soluciones del primer manierismo, o bien ir más allá, liberándose de todo formalismo.